共聚焦顯微鏡是一種基于點照明和空間針孔濾波技術的高分辨率光學成像儀器。它通過激光掃描樣本，并利用共軛焦點處的針孔有效消除焦外模糊光線，從而獲取比寬場顯微鏡更佳的對比度與信噪比。該系統(tǒng)能逐點掃描并重建清晰的光學切片，實現(xiàn)樣本三維結構的非侵入式觀測，廣泛應用于生命科學、材料分析等領域，尤其適用于活細胞動態(tài)研究與厚樣本的高分辨率成像。
 

　　然而，在使用過程中難免會遇到各種故障影響實驗進度。掌握系統(tǒng)的故障排查方法，能夠幫助科研人員迅速恢復設備正常運行，保障科研工作的連續(xù)性。本文將為您梳理常見故障類型及對應的解決方案。
 

　　共聚焦顯微鏡常見故障分類及處理：

 

　　一、 圖像質量相關問題
 

　　1. 圖像信噪比差，信號微弱
 

　　現(xiàn)象：圖像整體暗淡、顆粒感重，即使增加激光功率和增益也無法獲得清晰圖像。
 

　　可能原因及處理：
 

　　樣品制備問題：熒光染料淬滅、封片不當或有氣泡、樣品本身信號弱。處理：檢查樣品，重新制備或更換新樣品驗證。
 

　　物鏡不干凈：油污、灰塵等會嚴重影響光路通量。處理：用專用的鏡頭紙和清潔液小心清潔物鏡前透鏡。
 

　　激光功率過低或光路衰減過大：激光器壽命將至或濾光片設置不當。處理：檢查軟件中的激光功率設置，確認ND濾鏡(中性密度濾光片)是否處于關閉狀態(tài)。如懷疑激光器問題，需工程師檢測。
 

　　探測器(PMT)電壓或增益設置過低：處理：在允許范圍內適當提高PMT電壓或增益，但注意過高的增益會引入噪聲。
 

　　針孔孔徑過大：失去了共聚焦的優(yōu)勢。處理：確保針孔孔徑設置在最佳值(通常為1 Airy Unit左右)。
 

　　光路未準直：光路發(fā)生偏移。處理：需要工程師進行光路校準。
 

　　2. 圖像背景過高
 

　　現(xiàn)象：整個視野發(fā)亮，非特異性背景信號掩蓋了目標信號。
 

　　可能原因及處理：
 

　　非特異性染色或樣品自發(fā)熒光：處理：優(yōu)化染色流程，設置合適的陰性對照，嘗試使用抗淬滅封片劑。
 

　　二抗或染料非特異性結合：處理：在染色過程中增加封閉和洗滌步驟。
 

　　激光功率或探測器增益過高：處理：先嘗試降低PMT增益，如果信號隨之變弱但背景仍高，再適當降低激光功率。
 

　　針孔孔徑過大：允許更多焦外光進入。處理：減小針孔孔徑。
 

　　蓋玻片或物鏡上有臟污：處理：清潔蓋玻片和物鏡。
 

　　交叉對話(串色)：在多色成像時，一個通道的信號泄露到另一個通道。處理：優(yōu)化采集順序(先采集容易淬滅的通道)，或使用序列掃描而非同時掃描，并設置正確的光譜掃描范圍和分光鏡。
 

　　3. 圖像分辨率下降，模糊
 

　　現(xiàn)象：圖像細節(jié)丟失，邊緣模糊。
 

　　可能原因及處理：
 

　　樣品厚度或封片不當：蓋玻片厚度不標準(非0.17mm)或封片劑厚度不均，導致球差。處理：使用標準厚度蓋玻片和合適的浸油/水，確保封片均勻。
 

　　物鏡選擇錯誤或未校正像差：使用干鏡觀察浸液樣品，或未使用帶校正環(huán)的物鏡調節(jié)環(huán)。處理：確認使用正確的物鏡，如有校正環(huán)，根據蓋玻片厚度和浸液類型進行調整。
 

　　針孔孔徑過大：處理：將針孔調整到1 Airy Unit附近以獲得最佳分辨率和信噪比。
 

　　漂移：樣品或儀器本身的熱漂移或機械漂移。處理：確保樣品固定穩(wěn)定；開機后預熱系統(tǒng)30分鐘以上再采集；對于長時間活細胞成像，使用環(huán)境控制系統(tǒng)并選擇穩(wěn)定性好的載物臺。
 

　　4. 圖像中有條紋、陰影或明暗不均
 

　　現(xiàn)象：出現(xiàn)規(guī)律的掃描線、網格狀陰影或視野一邊亮一邊暗。
 

　　可能原因及處理：
 

　　激光束或掃描振鏡不穩(wěn)定：處理：重啟顯微鏡和計算機系統(tǒng)。如果問題持續(xù)，可能需要工程師校準掃描頭。
 

　　電源干擾：處理：確保顯微鏡連接到穩(wěn)定的電源，并遠離大功率設備。
 

　　物鏡或聚光鏡上有灰塵/纖維：處理：仔細清潔所有光學元件。
 

　　二、 硬件及機械問題
 

　　1. 無法對焦或聚焦不穩(wěn)定
 

　　現(xiàn)象：找不到焦平面，或焦距在成像過程中不斷變化。
 

　　可能原因及處理：
 

　　樣品未放平：處理：重新放置樣品，確保其與物鏡平行。
 

　　浸液使用不當：干鏡下有浸液，或浸液中有氣泡。處理：清潔物鏡和樣品，重新添加浸液并排除氣泡。
 

　　粗準焦螺旋松動：處理：檢查并鎖緊粗準焦螺旋。
 

　　Z軸驅動器故障或校準丟失：處理：需要工程師重新校準Z軸驅動單元。
 

　　2. 激光器無法打開或功率不穩(wěn)定
 

　　現(xiàn)象：軟件報激光器錯誤，或激光功率波動大。
 

　　可能原因及處理：
 

　　激光器達到壽命：處理：聯(lián)系工程師檢測激光器壽命，必要時更換。
 

　　激光器電源或冷卻系統(tǒng)故障：處理：切勿自行打開，立即聯(lián)系工程師。
 

　　控制軟件問題：處理：重啟計算機和顯微鏡控制系統(tǒng)。
 

　　3. 軟件無法連接硬件或控制失靈
 

　　現(xiàn)象：軟件報“硬件未找到”或“通信錯誤”，某些功能無法控制。
 

　　可能原因及處理：
 

　　數據線松動：處理：檢查所有連接線纜是否插緊。
 

　　軟件沖突或崩潰：處理：退出軟件，重啟計算機，再重新啟動軟件。
 

　　驅動程序損壞：處理：重新安裝硬件驅動程序(需管理員權限)。
 

　　防火墻或殺毒軟件攔截：處理：將顯微鏡控制軟件加入防火墻和殺毒軟件的白名單。
 

　　日常維護與預防
 

　　定期清潔：定期用專業(yè)工具清潔物鏡、目鏡、濾光片和載物臺。
 

　　保持環(huán)境穩(wěn)定：控制實驗室的溫度和濕度，減少振動，保持清潔。
 

　　正確開關機：遵循規(guī)定的開關機順序，關機前確保激光器已冷卻。
 

　　規(guī)范操作：使用標準耗材，正確添加浸液，避免碰撞光學元件。
 

　　使用校準樣品：定期使用熒光微球等校準樣品檢查系統(tǒng)分辨率和光路準直情況。
 

　　當遇到無法解決的復雜故障時，有效的方法就是及時聯(lián)系設備制造商的技術支持工程師，并提供詳細的故障現(xiàn)象描述和您已嘗試的排查步驟。